Cyfroteka.pl

klikaj i czytaj online

Cyfro
Czytomierz
00237 005870 13104443 na godz. na dobę w sumie
Elementy enzymologii i biochemii białek. Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii - ebook/pdf
Elementy enzymologii i biochemii białek. Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii - ebook/pdf
Autor: , Liczba stron: 76
Wydawca: Uniwersytet Śląski Język publikacji: polski
ISBN: 978-8-3801-2446-2 Data wydania:
Lektor:
Kategoria: ebooki >> popularnonaukowe >> biologia i chemia
Porównaj ceny (książka, ebook (-20%), audiobook).
Prezentowany skrypt jest przeznaczony dla studentów biologii, biotechnologii i innych kierunków pokrewnych, którym z założenia ma ułatwić przygotowanie do ćwiczeń, zaznajomienie się z podstawowymi metodami stosowanymi w enzymologii oraz wykonanie odpowiednich doświadczeń. Podręcznik został podzielony na trzy części, z których każda obejmuje: wstęp teoretyczny, stosowane podczas zajęć materiały i odczynniki, opis przebiegu doświadczeń oraz sposób opracowania uzyskanych wyników. Podana na zakończenie każdej części literatura źródłowa umożliwia czytelnikowi samodzielne zaplanowanie badań oraz bardziej wnikliwą analizę wyników. Skrypt zawiera informacje na temat izolacji i oczyszczania 1,2-dioksygenazy katecholowej oraz charakterystykę tego enzymu, badania kinetyki reakcji enzymatycznych, w tym wyznaczenie optymalnych warunków reakcji enzymatycznej, wyznaczenie stałych kinetycznych reakcji oraz określenie wpływu inhibitorów na przebieg reakcji enzymatycznej. Omawia również metody immobilizacji enzymów, a także wpływ immobilizacji na aktywność enzymów.
Znajdź podobne książki Ostatnio czytane w tej kategorii

Darmowy fragment publikacji:

Danuta Wojcieszyńska, Urszula Guzik Elementy enzymologii enzymologii enzymologii i biochemii białek t D a n u a W o c e s z y ń s k a i j , l U r s z u a G u z k i Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii l E e m e n t y e n z y m o o g l i i i i b o c h e m i i b a i ł e k Więcej o książce CENA 20 ZŁ (+ VAT) ISSN 1644-0552 ISBN 978-83-8012-446-2 KATOWICE 2015 Elementy enzymologii i biochemii białek Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii NR 166 Danuta Wojcieszyńska, Urszula Guzik Elementy enzymologii i biochemii białek Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego • Katowice 2015 Redaktor serii: Biologia Iwona Szarejko Recenzenci Ewa Kaczorek, Danuta Witkowska Spis treści Przedmowa . . . . . . . Wykaz stosowanych oznaczeń . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zasady bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązujące w Pracowni bio- chemii białek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. Izolacja i oczyszczanie enzymu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1. WPROWADZENIE . . 1.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 1.1.3. WYKONANIE . . . 1.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . riale biologicznym . cholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2 1.1.3.2. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej . 1.1.3.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda . . . . . 1.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej . . . . . . . . 1.1.3.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy kate- . . . 1.1.3.3.1. Przygotowanie krzywej wzorcowej . 1.1.3.3.2. Oznaczenie stężenia białka w badanym mate- . . 1.2. Wyznaczanie mas cząsteczkowych białek metodą sączenia żelowego . . . . 1.2.3.1. Wyznaczenie masy cząsteczkowej 1,2-dioksygenazy kate- . 1.2.3.2. Oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą chro- . . . . . . 1.3.3.1. Przygotowanie surowej frakcji enzymatycznej do elektro- . . 1.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . . . . oraz oczyszczanie białek metodą chromatografii jonowymiennej . . 1.2.1. WPROWADZENIE . . . 1.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 1.2.3. WYKONANIE . . 1.3. Elektroforeza dwuwymiarowa 2-DE białek . . . 1.3.1. WPROWADZENIE . . 1.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 1.3.3. WYKONANIE . cholowej metodą sączenia żelowego . matografii jonowymiennej . forezy 2-DE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 11 13 15 15 15 18 19 19 21 22 22 23 23 24 24 25 26 26 28 29 30 30 32 32 32 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . z Coomassie Brillant Blue i rozdział elektroforetyczny . 1.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . 1.3.3.2. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczania stęże- nia białka metodą Bradforda w obecności buforu do przy- . gotowywania próbek 2-DE 1.3.3.3. Rehydratacja pasków IPG . . 1.3.3.4. Izoogniskowanie białek z zastosowaniem pasków IPG . 1.3.3.5. Przygotowanie pasków do drugiego kierunku SDS-PAGE . 1.3.3.6. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą . . 1.4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturu- . . . . 1.4.3.1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek 1.4.3.2. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą . . . . jących . . 1.4.1. WPROWADZENIE . . 1.4.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI . 1.4.3. WYKONANIE z Coomassie Brillant Blue oraz metodą srebrową . . . 1.4.4. OPRACOWANIE I DOKUMNETACJA WYNIKÓW . . 1.5. Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . techolowej nazy katecholowej 2.1.1. WPROWADZENIE . . 2.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI . 2.1.3. WYKONANIE genazę katecholową . 2.1. Wyznaczanie optymalnych warunków reakcji enzymatycznej . . . . 2. Kinetyka reakcji enzymatycznej katalizowanej przez 1,2-dioksy- . . . . . 2.1.3.1. Badanie wpływu temperatury na aktywność 1,2-dioksyge- . 2.1.3.2. Badanie wpływu pH na aktywność 1,2-dioksygenazy ka- . . . . . . 2.2.3.1. Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność 1,2-dio- . . . . . . 2.3.3.1. Badanie wpływu 2,4-dichlorofenolu na aktywność 1,2-dio- . . 2.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . . . . . 2.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . . . . 2.2. Wyznaczanie stałych kinetycznych reakcji enzymatycznej . . . . . 2.3.1. WPROWADZENIE . . 2.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 2.3.3. WYKONANIE . 2.2.1. WPROWADZENIE . . 2.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI . 2.2.3. WYKONANIE 2.3. Inhibicja reakcji enzymatycznych . . ksygenazy katecholowej ksygenazy katecholowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 34 34 35 36 36 36 36 38 38 38 39 40 40 43 43 43 44 45 45 46 47 48 48 51 52 52 53 54 54 55 56 56 6 2.3.3.2. Badanie wpływu jonów niklu na aktywność 1,2-dioksy- . . . . 2.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . genazy katecholowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. Literatura 3. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . zy katecholowej . czania w obecności KOH . stężenia 3.1.1. WPROWADZENIE . . 3.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 3.1.3. WYKONANIE . . 3.1. Wpływ immobilizacji na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej . . . . . . . 3.1.3.1. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej . . 3.1.3.2. Oznaczanie stężenia białka w kulkach alginianowych . . . . . . . 3.1.3.2.1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej dla ozna- białka metodą Bradforda . 3.1.3.2.2. Oznaczanie stężenia białkach w kulkach algi- nianowych metodą Bradforda w obecności KOH . . 3.1.3.3. Oznaczanie aktywności immobilizowanej 1,2-dioksygena- . 3.1.3.4. Wpływ czasu przechowywania na aktywność wolnego . . . . . . 3.2.3.1. Badanie wpływu pH na aktywność wolnej i immobilizo- . 3.2.3.2. Badanie wpływu temperatury na aktywność wolnej i im- . 3.2.3.3. Badanie wpływu jonów metali oraz związków fenolo- wych na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dio- ksygenazy katecholowej . 3.2.3.4. Oznaczanie stężenia białka w surowej frakcji enzyma- . . . . 3.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . i immobilizowanego enzymu . . 3.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW . . . . . 3.2. Badanie właściwości immobilizowanego enzymu . . . 3.2.1. WPROWADZENIE . . 3.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI 3.2.3. WYKONANIE . mobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej. wanej 1,2-dioksygenazy katecholowej tycznej i w kulkach alginianowych . 3.3. Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 58 59 61 61 61 62 63 63 63 63 64 64 65 66 67 67 68 69 69 70 71 72 73 74 Przedmowa W ostatnim półwieczu nastąpił intensywny rozwój enzymatyki i biochemii białek. Jest to spowodowane rozwojem odpowiednich metod i technik badaw- czych, bez których nie byłoby możliwe oczyszczenie i zbadanie struktury białek. W Katedrze Biochemii Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach, pod kie- runkiem Pani prof. dr hab. Sylwii Łabużek, od prawie dwudziestu lat prowadzi się badania i zajęcia dydaktyczne związane z szeroko pojętą enzymatyką. Ni- niejszy podręcznik ma ułatwić studentom biologii, biotechnologii i innych kie- runków pokrewnych przygotowanie do ćwiczeń, zaznajomienie się z podstawo- wymi metodami stosowanymi w enzymologii oraz wykonanie odpowiednich doświadczeń. Skrypt podzielony został na trzy części, z których każda obejmuje: wstęp teoretyczny, stosowane podczas zajęć materiały i odczynniki, opis przebiegu doświadczeń oraz sposób opracowania uzyskanych wyników. Podana na zakoń- czenie każdej z części skryptu literatura źródłowa umożliwia czytelnikowi sa- modzielne zaplanowanie badań oraz bardziej wnikliwą analizę wyników. Moż- liwość zapoznania się z prezentowaną literaturą jest tym istotniejsza, że materiały zawarte w podręczniku nie wyczerpują przedstawianych w nim za- gadnień. Autorki mają nadzieję, że skrypt będzie stanowić istotną pomoc w naucza- niu enzymologii oraz biochemii białek. Jednak zdając sobie sprawę z pewnych jego niedociągnięć, będą wdzięczne za wszelkie wskazówki Czytelników, które mogą być pomocne w przygotowywaniu kolejnego wydania podręcznika. Serdecznie dziękują także Pani dr hab. Katarzynie Hupert-Kocurek za kry- tyczne uwagi zgłaszane podczas opracowywania niniejszego skryptu. Danuta Wojcieszyńska, Urszula Guzik Wykaz stosowanych oznaczeń 2-DE A280 APS CBB G-250 — błękit brylantynowy G-250 (ang. Coomassie Brillant Blue — dwuwymiarowa elektroforeza żelowa — absorbancja białka przy długości fali 280 nm — nadsiarczan amonu (ang. ammonium persulfate) CHAPS — niejonowy detergent siarczan 3-[(3-cholamidopropylo)dime- G250) — zmiana stężenia tyloamonio]-1-propanu CM-celuloza — karboksymetyloceluloza CM-Sephadex — karboksymetylo-Sephadex dC DEAE-celuloza — dietyloaminoetyloceluloza DMAP DTE GC/MS h IEF IPG Km MW NP-40 PMSF SDS SDS-PAGE — β-dimetyloaminopropionitryl — ditioerytritol — chromatograf gazowy sprzężony z detektorem masowym — współczynnik interakcji Hilla — ogniskowanie izoelektryczne — paski do izoogniskowania (ang. immobilized pH gradient) — stała Michaelisa-Menten — masa cząsteczkowa — niejonowy surfaktant Nonidet P-40 — fluorek fenylometylosulfonylu — dodecylosiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate) — elektroforeza w warunkach denaturujących (ang. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) t TEMED Tris v V0 v0 Ve’ Ve Vmax Vt — czas — N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina — 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol — szybkość reakcji enzymatycznej — objętość elucyjna Blue Dextranu — szybkość początkowa reakcji enzymatycznej — objętość elucyjna białka badanego — objętość elucyjna białka wzorcowego — szybkość maksymalna reakcji enzymatycznej — objętość całkowita kolumny 11 DIFP S F NP CP — diizopropylofluorofosforan — stężenie substratu — fenol — 2-nitrofenol — 2-chlorofenol Zasady bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązujące w Pracowni biochemii białek cia napojów. bezpieczeństwa. i buty z podeszwą antypoślizgową. • Osoby przebywające w laboratorium powinny przestrzegać wszystkich zasad • Strojem obowiązującym w Pracowni biochemii białek są fartuch ochronny • Na terenie Pracowni obowiązuje całkowity zakaz spożywania pokarmów i pi- • Nie wolno przebywać na terenie Pracowni oraz uruchamiać aparatury bez • Każdy student zobowiązany jest do utrzymywania czystości w miejscu pra- cy. Odczynniki potrzebne do doświadczeń znajdują się na odpowiednich półkach. Po pobraniu odczynnika każdorazowo należy zamknąć butelkę korkiem i odstawić na właściwe miejsce. Do każdego odczynnika stosuje się oddzielną pipetę (w przypadku pipet automatycznych — oddzielną koń- cówkę). zgody osoby prowadzącej zajęcia. • W czasie pracy z materiałem biologicznym oraz odczynnikami chemicznymi nie wolno dotykać rękami twarzy. Należy unikać rozlewania i rozchlapywania odczynników, prace z substancjami trującymi wykonywać pod wyciągiem w rękawiczkach, a jeśli wymagają tego odrębne przepisy, również w okula- rach i masce ochronnej. pojemników. do udzielenia pierwszej pomocy. powiadomić osobę prowadzącą zajęcia. • Papier, szkło, bibułę, materiał biologiczny należy wyrzucać do odpowiednich • O każdym niebezpiecznym zdarzeniu (np. skaleczenie) należy bezwzględnie • W laboratorium znajduje się apteczka zaopatrzona w leki i sprzęt niezbędny • W przypadku oparzenia się kwasem oblane miejsce natychmiast spłukać wodą, a następnie wodą wapienną lub roztworem wodorowęglanu sodowego. • Oparzone lub zanieczyszczone oczy należy przemyć, korzystając z płuczki do • Miejsce oparzone termicznie należy schłodzić pod bieżącą wodą, po czym pokryć pianką typu Panthenol. W przypadku rozległego oparzenia udać się do lekarza. oczu, a następnie udać się do lekarza. • W przypadku skaleczenia ranę należy odkazić 70 alkoholem lub wodą utle- nioną i opatrzyć sterylną gazą. W przypadku silnego krwawienia założyć po- 13 wyżej rany opaskę uciskową na okres nie dłuższy niż 1 godz. i wezwać lekarza. nie umyć ręce. • W przypadku awarii sprzętu, rozbicia naczyń szklanych lub rozlania bądź rozsypania odczynnika chemicznego o zaistniałym zdarzeniu należy powia- domić prowadzącego zajęcia. • Po zakończeniu ćwiczeń należy uporządkować stanowisko pracy oraz staran- Redaktor Barbara Todos-Burny Projektant okładki Magdalena Starzyk Redaktor techniczny Barbara Arenhövel Łamanie Edward Wilk Copyright © 2015 by Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego Wszelkie prawa zastrzeżone ISSN 1644-0552 ISBN 978-83-8012-445-5 (wersja drukowana) ISBN 978-83-8012-446-2 (wersja elektroniczna) Wydawca Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego ul. Bankowa 12B, 40-007 Katowice www.wydawnictwo.us.edu.pl e-mail: wydawus@us.edu.pl Wydanie I. Ark. druk. 4,75. Ark. wyd. 5,5. Papier offset. kl. III, 90 g Cena 20 zł (+ VAT) Druk i oprawa: „TOTEM.COM.PL Sp. z o.o.” Sp.K. ul. Jacewska 89, 88-100 Inowrocław Danuta Wojcieszyńska, Urszula Guzik Elementy enzymologii enzymologii enzymologii i biochemii białek t D a n u a W o c e s z y ń s k a i j , l U r s z u a G u z k i Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii l E e m e n t y e n z y m o o g l i i i i b o c h e m i i b a i ł e k Więcej o książce CENA 20 ZŁ (+ VAT) ISSN 1644-0552 ISBN 978-83-8012-446-2 KATOWICE 2015
Pobierz darmowy fragment (pdf)

Gdzie kupić całą publikację:

Elementy enzymologii i biochemii białek. Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii
Autor:
,

Opinie na temat publikacji:


Inne popularne pozycje z tej kategorii:


Czytaj również:


Prowadzisz stronę lub blog? Wstaw link do fragmentu tej książki i współpracuj z Cyfroteką: