W pracy przedstawiono i przedyskutowano wyniki badań przemian strukturalnych surowiczej albuminy ludzkiej i wołowej, przebiegających pod wpływem kontrolowanego wzrostu temperatury w roztworach wodnych. Zastosowanie wysokiej jakości czułego mikrokalorymetru pozwoliło prześledzić subtelne zmiany zachodzące w białku pod wpływem takich czynników środowiskowych, jak radiowe (RF) i ultrafioletowe (UV) promieniowanie elektromagnetyczne. Udokumentowano występowanie różnic w przebiegu termicznego rozfałdowania albuminy wolnej i zawierającej kwasy tłuszczowe, reakcji obydwu form białka na promieniowanie UV oraz w wiązaniu denaturantów (etanolu). Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem matematycznym pozwoliło scharakteryzować założony proces termicznej denaturacji trójdomenowego białka, jakim jest albumina.
Darmowy fragment publikacji:
Cena 15 zł
Anna Michnik
badania
Mikrokalorymetryczne
przemian
poddanej
czynników
konformacyjnych
dział aniu
wybranych
fizykochemicznych
albuminy
A
n
n
a
M
c
h
n
k
i
i
Mikrokalorymetryczne
badania
przemian
konformacyjnych
albuminy...
ISSN 0208-6336
ISBN 978-83-8012-866-8
Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego Katowice 2009
Mikrokalorymetryczne badania
przemian konformacyjnych albuminy
poddanej działaniu
wybranych czynników fizykochemicznych
NR 2681
Anna Michnik
Mikrokalorymetryczne badania
przemian konformacyjnych albuminy
poddanej działaniu
wybranych czynników fizykochemicznych
Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego
Katowice 2009
Redaktor serii: Fizyka
WładysłaW Borgieł
Recenzenci
anna sułkoWska, LiLianna Trynda-Lemiesz
Spis treści
Wprowadzenie .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1. Białka: konformacja, pojemność cieplna .
.
.
1.1. Stan konformacyjny białka .
1.2. Pojemność cieplna białek
.
.
.
.
.
2. Albumina — struktura i funkcje .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
3. Badania DSC białek .
.
.
3.1. Termiczne rozfałdowanie białka
.
3.2. Aspekty kinetyczne w procesie denaturacji białek — model Lumry—
.
Eyringa .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC .
.
.
4.1. Podstawy analizy dekonwolucyjnej
4.2. Przejścia niezależne .
.
.
.
4.2.1. Model niezależnych przejść dwustanowych, uwzględniający efek-
.
4.2.2. Model niezależnych przejść dwustanowych, z wykluczeniem efek-
.
.
.
.
.
.
4.3. Przejścia sekwencyjne
.
4.4. Pojedyncze przejście dwustanowe z dysocjacją podjednostek .
.
4.2.3. Model niezależnych przejść niedwustanowych
.
tów ∆Cp.
ty ∆Cp
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
5. Proces termicznej denaturacji albuminy w roztworach wodnych .
.
5.1. Charakterystyka DSC termicznej przemiany pomiędzy stanem natywnym
.
i zdenaturowanym albuminy.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
7
13
13
15
20
24
24
31
35
35
37
39
40
40
41
42
44
44
5
.
i wołowej
5.2. Specyfika termicznych przemian konformacyjnych albuminy ludzkiej
.
5.3. Wpływ obecności kwasów tłuszczowych na charakter termicznego roz-
.
.
.
5.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy .
fałdowania albuminy .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
6. Termiczna denaturacja albuminy surowicy w roztworach wodnych mody-
fikowanych wybranymi czynnikami chemicznymi .
.
.
6.1. Przemiany BSA w roztworach o pH w zakresie 3,5—7,0 .
.
6.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w roztworach wodnych eta-
.
nolu .
.
6.2.1. Białka w roztworach wodno-alkoholowych
.
6.2.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w obecności etanolu .
6.2.3. Wiązanie etanolu do albuminy .
.
6.2.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy w roztworach
.
etanol-woda
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
7. Skutki ekspozycji roztworów wodnych albuminy na wybrane zakresy pro-
mieniowania elektromagnetycznego
.
7.1. Wpływ promieniowania o częstości radiowej na trwałość konformacji
.
7.2. Konformacyjna reorganizacja albuminy pod wpływem promieniowania
.
albuminy wołowej.
UV .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
48
52
54
63
63
71
71
73
75
79
84
84
92
Podsumowanie .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
105
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Dodatek .
.
.
.
D I. Wiązanie kwasów tłuszczowych do albuminy
D II. Siły stabilizujące strukturę białka .
.
.
D III. Wpływ środowiska na konformacyjną stabilność makromolekuły białka .
.
D IV. Pomiary kalorymetryczne i spektrofotometryczne .
D V. Analiza statystyczna wyników .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Literatura .
.
Summary .
.
Zusammenfassung.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
6
109
109
111
114
119
120
121
139
141
Wprowadzenie
Inspiracją do badań przemian konformacyjnych białek zachodzących pod
wpływem czynników fizykochemicznych jest wiele niewyjaśnionych w pełni
kwestii dotyczących zależności pomiędzy zmianą natywnej struktury białek
w wyniku oddziaływania ze środowiskiem a skutkami, jakie te modyfikacje
niosą dla organizmów żywych. Narażenie środowiskowe jest zazwyczaj naraże-
niem mieszanym na wiele czynników o różnych stężeniach bądź natężeniach.
Efekt końcowy jednoczesnego działania wielu czynników zależy od interakcji
między nimi, a w przypadku organizmów żywych także od ich indywidualnych
reakcji i odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Prowadzenie badań in vitro,
mających na celu poznanie wpływu każdego z czynników oddzielnie lub ich
ograniczonej kombinacji nie na obiekty żywe, lecz na ich wyodrębnione skład-
niki, nie jest w stanie zastąpić badań in vivo. Jedną z wielu przyczyn jest trud-
ność wiernego odtworzenia warunków fizjologicznych, na przykład tzw. za-
tłoczenia molekularnego panującego w komórce, od którego w bardzo istotny
sposób uzależnione są konformacje makromolekuł, aktywność enzymów i szyb-
kość reakcji biochemicznych (MINTON, 2001, 2005; ELLIS, 2001; CHEBOTAREVA
et al., 2004). Na obecnym etapie wiedzy selektywne badania modelowe, mimo
określonych założeń upraszczających, nadal wnoszą istotny wkład w poznanie
i zrozumienie zjawisk fizycznych leżących u podłoża procesów, wywołujących
określone skutki w danych warunkach środowiskowych.
Białka, podstawowe składniki każdej komórki, biorą udział w licznych pro-
cesach fizjologicznych: przenoszeniu i magazynowaniu różnych substancji, utle-
nianiu tkankowym, krzepnięciu krwi, procesach odpornościowych, procesach
widzenia, przewodzeniu bodźców nerwowych, skurczu mięśni, dostarczaniu
energii, regulacji procesów metabolicznych — stężenia jonów, ciśnienia osmo-
tycznego. Wszystkie te funkcje wypełniają one dzięki odwracalnym zmianom
specyficznej struktury przestrzennej każdego z nich.
7
Zdobycie wszechstronnych informacji na temat trwałości struktur białko-
wych jest ważne w aspekcie współczesnych badań farmaceutycznych. W ostat-
nich latach powstaje wiele nowych leków na bazie białek, przy czym najwięk-
szym problemem jest zwykle mała trwałość tych farmaceutyków. Dodatkowo
procesy technologiczne prowadzące do ostatecznej formy bezpiecznego i sku-
tecznego (aktywnego) preparatu, składają się z procedur, które mogą modyfiko-
wać białko w niepożądany sposób. Wyjściowy materiał poddawany jest np.
działaniu promieniowania jonizującego, UV (254 nm) czy termicznej steryliza-
cji w celu zniszczenia bakterii i wirusów. Te działania nie pozostają prawdopo-
dobnie bez wpływu na strukturę i właściwości makromolekuł.
się
do
zaburzeń
jej
przyczynia
Albumina jest to białko surowicy krwi, które obficie występuje w organi-
zmach ssaków. Pomimo tego że zarówno struktura, jak i podstawowe funkcje al-
buminy zostały stosunkowo dobrze poznane, nie przestaje ona być obiektem
wszechstronnych badań naukowych. Wybrane, zdaniem autorki ważne w kon-
tekście pracy, informacje na temat tego białka przedstawiono w rozdziale 2. Po-
znanie wpływu różnych czynników fizykochemicznych na właściwości albumi-
ny
funkcji. Termiczne
charakterystyki albuminy dostarczają cennych wskazówek w kontekście jej za-
stosowań praktycznych, np. w laserowym zespalaniu tkanek (BLEUSTEIN et al.,
2000 a, b), metodzie alternatywnej do zszywania chirurgicznego. Albuminy
używa się jako „lutu” w celu poprawy konsystencji
i zwiększenia wytrzy-
małości blizny. Termiczna pasteryzacja roztworów albuminy poprzedza ich za-
stosowania kliniczne (przeprowadza się ją ze względu na możliwość obecności
wirusów, np. HIV, opryszczki, zapalenia wątroby).
zrozumienia
Badania termicznej denaturacji albuminy dostarczają ważnych informacji na
temat wewnątrz- i międzydomenowych oddziaływań istotnych dla stabilizacji
aktywnej formy białka. Zachowanie się albuminy pod wpływem temperatury
badano różnymi metodami, a najczęściej techniką dichroizmu kołowego (CD)
(TAKEDA et al., 1989; ARAKAWA et al., 2000; WATANABE et al., 2001;
KRAGH-HANSEN et al., 2005) i różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC)
(ANRAKU et al., 2007; BARONE et al., 1995; FARRUGGIA, PICÓ, 1999; GIANCOLA
et al., 1997; MICHNIK, 2003; ROSS, SHRAKE, 1988; TIKTOPULO et al., 1985;
YAMASAKI et al., 1990, 1991, 1992).
Nowoczesna aparatura pozwala na badanie zmian zachodzących w struk-
turze białek na poziomie molekularnym. Uchwycenie tych zmian i powiązanie
ich z funkcjami białek wzbogaca wiedzę dotyczącą prawidłowości funkcjo-
nowania naszych organizmów, a także podłoża niektórych chorób. Zaburzenia
konformacyjne białek leżą u podstaw takich chorób układu pozapiramidowego
jak: choroba Parkinsona, otępienie, z ciałami Lewy’ego (ang. Dementia with
Lewy bodies — DLB), postępujące porażenie nadjądrowe. Nieprawidłowa
struktura białek ma także związek z chorobą Alzheimera i chorobą prionową
BSE.
8
Relacje między strukturą a funkcją białek zależą silnie od oddziaływań
z rozpuszczalnikiem. Problem ten jest szeroko badany od wielu lat i mimo to
wciąż żywo dyskutowany. Ponieważ większość białek funkcjonuje w roztworach
wodnych, znaczenie wody i zrozumienie różnych aspektów oddziaływań w śro-
dowisku wodnym jest szczególnie ważne. Aktywność białka oraz jego konfor-
macyjna elastyczność są w dużym stopniu uwarunkowane obecnością wody.
Struktura natywnych białek jest określona przez równowagę wewnątrz- i mię-
dzymolekularnych oddziaływań pomiędzy różnymi resztami aminokwasowymi
oraz tymi resztami i molekułami wody otaczającymi białka. Ta równowaga
określa tendencję poszczególnych reszt aminokwasowych do preferowania wnę-
trza lub powierzchni białka. Może być zmieniona np. przez denaturanty czy sta-
bilizatory obecne w roztworze, jak również przez zmiany temperatury, ciśnie-
nia, pH czy siły jonowej. Ogólna struktura białek jest wtedy osłabiana lub
wzmacniana, zależnie od właściwości molekuł. Badanie tych zmian dostarcza
wartościowej informacji na temat roli rozpuszczalnika w utrzymaniu konforma-
cji natywnego białka. Krótkie omówienie oddziaływań istotnych dla stabilizacji
struktury białka oraz czynników modyfikujących ją zawarto w rozdziałach D II
i D III Dodatku.
Od dawna bada się wpływ podstawowych czynników fizycznych: temperatu-
ry i ciśnienia, na trwałość struktur białkowych. Paradoksalnie, śledzenie procesu
denaturacji, a więc niszczenia struktury białka, pozwala lepiej poznać i zrozu-
mieć oddziaływania kluczowe w procesie fałdowania białka do specyficznej dla
niego konformacji oraz istotne dla stabilizacji tej struktury. Większość zagad-
nień dyskutowanych w tej pracy skupia się wokół termicznej denaturacji białek,
a pewne aspekty denaturacji ciśnieniowej przedyskutowano w rozdziale D III
Dodatku.
Konformacja białka może być również zmieniana pod wpływem innych
jonizującego promieniowania gamma (SZWEDA-
czynników fizycznych, np.
-LEWANDOWSKA et al., 1976; FESSAS et al., 1998; LEE et al., 2000; LEE, SONG,
2002; CHO, SONG, 2000; CIEŚLA et al., 2000). Autorzy niektórych prac zwracają
uwagę, że także podczas badań krystalograficznych struktury białek promienia-
mi X ulega ona zmianie, co powoduje różnice pomiędzy strukturami: natywną
i stwierdzoną na podstawie eksperymentu dyfrakcyjnego (NAVE, 1995; CARUGO,
CARUGO, 2005).
Wyniki badań mikrokalorymetrycznych prezentowane w tej pracy wykazały,
że także promieniowanie elektromagnetyczne niejonizujące z zakresu UV oraz
radiowego prowadzi do strukturalnych modyfikacji jednego z głównych białek
osocza — albuminy (MICHNIK et al., 2004 a, b, 2008).
Pomiar kalorymetryczny umożliwia bezpośrednie wyznaczenie makroskopo-
wej wielkości termodynamicznej — entalpii badanego procesu. Ze względu na
kompensację entalpowo-entropową sama wartość zmian energii swobodnej
Gibbsa (entalpii swobodnej), miary konformacyjnej stabilności białka nie jest
9
wystarczająca do prawidłowego opisu termodynamiki przemiany. Znaczące
udoskonalenie aparatury kalorymetrycznej oraz pojawienie się komercyjnie do-
stępnych kalorymetrów o wysokiej czułości, np. różnicowych kalorymetrów
skaningowych DSC, charakteryzujących się czułością ułamka mikrowata, przy-
czyniło się do zastosowania metod kalorymetrycznych w badaniach przemian
zachodzących w białkach pod wpływem temperatury. Dobrej jakości mikroka-
lorymetry umożliwiają detekcję nawet stosunkowo słabych, subtelnych zmian
wywoływanych w energetyce tych przemian różnorodnymi czynnikami. Mikro-
kalorymetr VP DSC (MicroCal Co.), stosowany w badaniach, których wyniki
prezentowane są w tej pracy, należy do klasy takich wysokoczułych kaloryme-
trów, przeznaczonych do badania próbek w stanie ciekłym i w szczególności
bardzo dobrze nadaje się do badania roztworów białek.
Obecnie zgromadzono pokaźny materiał doświadczalny dotyczący badań
termicznej denaturacji białek metodą DSC. Złożoność obserwowanych prze-
mian, ich zależność od specyfiki badanych struktur białkowych, jak i wielu
czynników doświadczalnych stanowi o atrakcyjności problematyki, a jednocze-
śnie utrudnia porównywanie wyników uzyskiwanych przez różnych autorów.
W niniejszym opracowaniu ograniczono się do zaprezentowania i przedyskuto-
wania na podstawie dostępnych danych literaturowych zagadnień dotyczących
termicznych przemian albuminy. Wiele z zawartych treści ma jednak uniwersal-
ny charakter i ilustruje różnorodność oraz specyfikę problemów związanych
z analizą procesów przebiegających w roztworach białek pod wpływem wzrostu
temperatury.
Termiczne rozfałdowanie białka uważa się za przejście globalne, co ozna-
cza, że procesowi temu w określonych warunkach ulega cząsteczka jako całość,
a nie polega ono na stopniowym osłabieniu struktury ze wzrostem temperatury
(JACKSON, 2006). Dla małych białek globularnych proces ich termicznej denatu-
racji może być często rozpatrywany jako dwustanowy, na co wskazuje zgodność
entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa (PRIVALOV, 1979), tzn. że w temperatu-
rach bliskich przejściu współistnieją dwa stany: natywny i
rozfałdowany.
W przypadku większych białek, wielodomenowych lub złożonych z kilku pod-
jednostek, opis procesu staje się bardziej skomplikowany. Jeśli wszystkie pod-
jednostki ulegają rozfałdowaniu równocześnie, przejście nazywane jest koopera-
tywnym. Kooperatywnemu rozfałdowaniu białka złożonego z n identycznych
podjednostek towarzyszy efektywna zmiana entalpii na mol n-meru, czyli ental-
pia van’t Hoffa n razy większa od entalpii rozfałdowania pojedynczej podjed-
nostki. Entalpia van’t Hoffa określa stromość przejścia: im większa koopera-
tywność,
strome.
Porównanie entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa dostarcza informacji na te-
mat liczby kooperatywnych podjednostek ujawniających się podczas przejścia.
Denaturację niektórych dużych białek można opisać jako sumę procesów dena-
turacji ich składowych domen.
tym większa efektywna entalpia i przejście bardziej
10
Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem teoretycz-
nym pozwala uzyskać informacje na poziomie molekularnym. Celem autorki tej
pracy było zaadaptowanie dostępnych modeli analizy dekonwolucyjnej danych
kalorymetrycznych, opisanych w rozdziale 4, do opisu przemian konformacyj-
nych zachodzących w cząsteczce albuminy. Śledząc doniesienia literaturowe,
można się dopatrzyć stosowania uproszczeń interpretacyjnych i niezgodności
między modelami proponowanymi do opisu procesu termicznego rozfałdowania
albuminy. Zostało to uwzględnione w dyskusji zagadnień przeanalizowanych
w niniejszej pracy.
Ważnym celem podjętych prac badawczych było wykazanie różnic w prze-
biegu procesu termicznego rozfałdowania albuminy pozbawionej kwasów tłusz-
czowych oraz nieodtłuszczonej. Problem przyłączania kwasów tłuszczowych do
albuminy był w ostatnich latach szeroko badany, co zrelacjonowano krótko
w rozdziale D I Dodatku. Konsekwencje dowiedzionych zmian konformacyj-
nych albuminy, związanych z przyłączaniem kwasów tłuszczowych (CURRY
et al., 1998; SUGIO et al., 1999; BHATTACHARYA et al., 2000), nie zostały jeszcze
dostatecznie poznane. W bieżącej pracy dużo uwagi poświęcono dyskusji na te-
mat odmiennych reakcji obydwu form albuminy na działanie stosowanych
czynników fizykochemicznych. Na osiągnięcie tego celu złożyło się kilka po-
średnich zadań badawczych: charakterystyka termicznego rozfałdowania albu-
miny odtłuszczonej i zawierającej kwasy tłuszczowe w roztworach wodnych
oraz w roztworach etanolu, zbadanie różnic w wiązaniu etanolu oraz porówna-
nie wpływu promieniowania UV na różniące się zawartością kwasów tłuszczo-
wych formy albuminy.
Aby uwiarygodnić wnioski płynące z porównania wyznaczonych para-
metrów termodynamicznych oraz obserwowanych tendencji ich zmian, prze-
prowadzono analizę statystyczną prezentowanych wyników w programie
STATISTICA 7.0 (Dodatek D V).
11
Anna Michnik
Microcalorimetric study of albumin conformational changes induced by various physicochemical factors
S u m m a r y
Thermal unfolding of albumin in aqueous solutions proceeding under different
physico-chemical conditions has been investigated using differential scanning calorime-
try (DSC). The dependence of the observed conformational restructuring on the kind of
albumin (human, bovine), its form (fatty acid free and nondefatted), the properties of
solvent (water, ethanol solutions), ionic strength, pH, protein concentration and experi-
mental conditions has been discussed in this work. The endothermic unfolding transi-
tion has been shown to be modified by time changes and changes induced by such envi-
ronmental factors as radio frequency radiation or UV radiation.
Considering the process of albumin thermal unfolding within the equilibrium ther-
modynamics, a deconvolution of DSC traces have been performed using the appropriate
mathematical models. Structurally independent subunits revealed during thermal dena-
turation of albumin has been found pH dependent. At pH range corresponding to the N
form of albumin these subunits could be correlated with three albumin domains for hu-
man albumins and nondefatted bovine albumin. Under the same conditions two subunits
have been revealed for fatty acid free bovine albumin: C-terminal fragment containing
domain III and the greater part of domain II and the N-terminal fragment containing
domain I and the smaller part of domain II.
DSC study of albumin in ethanol solutions has revealed stronger binding of ethanol
to defatted than to nondefatted albumin. The interaction of ethanol with fatty acid bind-
ing sites located in subdomain IIA has been confirmed. Ethanol has been observed to
be a stabilizer of the folded state of albumin at a lower concentration contrary to the
high denaturant concentration where its binding to the unfolded protein predominates.
The obtained results indicate that the influence of radiofrequency radiation (from
several to tens MHz) on albumin unfolding events could be detected using ultrasensitive
microcalorimeter. That influence is not observed immediately, however, the differences
between DSC profiles for irradiated and nonirradiated albumin solutions have appeared
during their storage. The changes in irradiated samples outpace nonirradiated ones.
Calorimetric and spectroscopic results have shown the conformational restructuring
of albumin under UV irradiation. The differences in response to UV radiation between
nondefatted and fatty acid free albumins have been found. Albumin devoid of endoge-
139
nous fatty acids has been suggested to be more susceptible to aggregation caused by
UV A—C as well as 254 nm UVC radiation. DSC curve deconvolution results allow to
conclude that the C-terminal fragment of albumin macromolecule, containing domain
III, is the most liable part to UV radiation.
The studies presented by the author have revealed the fundamental role of the pres-
ence of fatty acids for the thermal stability, conformational rearrangement and binding
properties of albumin macromolecule.
Anna Michnik
Mikrokalorimetrische Untersuchungen von Konformationsumwandlungen
des dem Einfluss von ausgewählten physikochemischen Faktoren ausgesetzten Albumins
Z u s a m m e n f a s s u n g
Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Ergebnisse der Untersuchungen von struktu-
rellen Umwandlungen des Albumins unter dem Einfluss der kontrollierten Temperatur-
zunahme in wässerigen Lösungen. Die thermische Entfaltung der dem Einfluss von ver-
schiedenen physikochemischen Faktoren ausgesetzten menschlichen Albumine und
Rindsalbumine wurde mit Hilfe der differentialen Scanningmikrokalorimetrie (DSC)
untersucht. Man diskutierte die Abhängigkeit des genannten Prozesses von der Art des
Albumins (menschliches Albumin, Rindsalbumin), dessen Struktur (fettsäurereiches Al-
bumin, entfettetes Albumin), von der modifizierten Zusammensetzung und Eigenschaf-
ten des Lösungsmittels (Wasser, wässerige Äthanollösungen), dessen Ionenkraft, pH,
von Eiweißkonzentration und von den Versuchsbedingungen. Es wurde festgestellt, dass
der bei thermischer Entfaltung beobachtete endotherme Übergang von DSC spiegelt die
in den untersuchten Eiweißlösungen mit der Zeit und unter dem Einfluss von äußeren
Umweltfaktoren eingetretenen Änderungen wider.
Die thermische Entfaltung des Albumins der Gleichgewichtsthermodynamik gemäß
untersuchend analysierte man die Funktion der Überschusswärmekapazität des Eiweiß-
körpers mit Hilfe der entsprechenden mathematischen Modelle. Es wurden die im Pro-
zess der thermischen Denaturierens erscheinenden, strukturellen, von pH abhängenden
Untereinheiten abgetrennt. Es wurde festgestellt, dass diese Untereinheiten in wässeri-
gen Lösungen mit den dem N-Albumin entsprechenden pH-Werten mit drei Moleküldo-
mänen des menschlichen Albumins und des nicht entfetteten Rindsalbumins korreliert
werden können. Die Entfaltung des entfetteten Rindsalbumins verläuft in den Umstän-
den mit der Aufteilung in zwei Untereinheiten: den die III. Domäne und den größten
Teil der II. Domäne umfassenden C- Endteil, und den aus der I. Domäne und dem klei-
neren Teil der II. Domäne gebildeten N- Endteil.
Aus der Beobachtung von thermischen Charakteristiken des Albumins in wäss-
erigen Äthanollösungen wurde geschlossen, dass sich das Äthanol besser mit entfette-
tem als mit nicht entfettetem Albumin verbindet. Die Vermutungen, dass das Äthanolm-
olekül die Verbindungsstellen der Fettsäure in der Subdomäne IIA einnimmt, haben
sich bestätigt. Man stellte folgendes fest: die Struktur des Albumins wird durch kleine
141
Dank der Anwendung von einem hochspezialisierten und hochempfindlichen Mi-
krokalorimeter wurde nachgewiesen, die RF-Strahlung mit der Frequenz von einigen
MHz bis ein paar Dutzenden MHz beeinflusst die thermische Umwandlungen in wässe-
rigen Albuminlösungen. Die Folgen der Einwirkung der Exposition auf die Strahlung
werden nicht sofort beobachtet. Sie bestehen in der temporalen Beschleunigung von den
im Eiweißkörper ablaufenden Umwandlungen.
Auf Grund der kalorimetrischen und spektroskopischen Untersuchungen UV VIS
wurde festgestellt, dass die UV-Strahlung ein solcher Faktor ist, der im Stande ist, die
normale Struktur aller untersuchten Albuminarten durch Modifizierung der Eiweißkon-
formation sehr deutlich zu verändern und die Eiweißaggregation zu verursachen. Nach-
gewiesen wurden auch unterschiedliche Reaktionen des fettsäurefreien Albumins und
des fettsäurereichen Albumins auf die UV-Strahlung. Das erste von ihnen war viel emp-
findlicher sowohl gegen die UV-Strahlung in deren vollem Bereich A-C, als auch gegen
die UVC-Strahlung mit der Wellenlänge von 254 nm. Es wurde daraus geschlossen,
dass die an das Makromolekül des Albumins auf natürliche Weise angeschlossenen
Fettsäuren eine Schutzfunktion ausüben und die Aggregation des Eiweißkörpers verhin-
dern. Die Anpassungsparameter von DSC-Versuchskurven in entwickelten Modellen be-
stätigten unterschiedliche Reaktion der Albumine mit verschiedenem Gehalt der Fett-
säure auf die UVC-Strahlung. Dank den Ergebnissen der Konvolutionsanalyse konnte
man zum Schluss kommen, das der C-Endteil des Albumins mit der Domäne II. in
höchstem Grade der UV-Strahlung ausgesetzt ist.
Konzentrationen des Äthanols stabilisiert und durch hohe Konzentrationen des Äthanols
destabilisiert, und die Eigenschaften der Bindung des Äthanols mit Albumin hängen
von der Konzentration des Äthanols ab.
Die durchgeführten Untersuchungen haben wesentliche Unterschiede im Verlauf der
thermischen Entfaltung des freien und des fettsäurereichen Albumins aufgezeigt, indem
sie kleinere thermische Beständigkeit des entfetteten Albumins bestätigt haben. Die mit
der Fettsäureanlagerung verbundenen Konformationsumwandlungen verursachen eine
unterschiedliche Reaktion der beiden Albuminarten auf die UV-Strahlung und unter-
schiedliche Äthanolbindungen.
Redakcja
Grażyna Wojdała
Redakcja techniczna
BarBara arenhövel
Korekta
MirosłaWa żłoBińska
Copyright © 2009
by Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego
Wszelkie prawa zastrzeżone
ISSN 0208-6336
ISBN 978-83-226-1840-0
(wersja drukowana)
ISBN 978-83-8012-866-8
(wersja elektroniczna)
Wydawca
Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego
ul. Bankowa 12B, 40-007 Katowice
www.wydawnictwo.us.edu.pl
e-mail: wydawus@us.edu.pl
Wydanie I. Ark. druk. 9,0. Ark. wyd. 9,5.
Przekazano do łamania w styczniu 2009 r.
Podpisano do druku w lutym 2009 r.
Papier offset. kl. III, 90 g Cena 15 zł (+ VAT)
Łamanie: Pracownia Składu Komputerowego
Wydawnictwa Uniwersytetu Śląskiego
Druk i oprawa: EXPOL, P. Rybiński, J. Dąbek, Spółka Jawna
ul. Brzeska 4, 87-800 Włocławek
Cena 15 zł (+VAT)
Anna Michnik
badania
Mikrokalorymetryczne
przemian
poddanej
czynników
konformacyjnych
dział aniu
wybranych
fizykochemicznych
albuminy
A
n
n
a
M
c
h
n
k
i
i
Mikrokalorymetryczne
badania
przemian
konformacyjnych
albuminy...
ISSN 0208-6336
ISBN 978-83-8012-866-8
Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego Katowice 2009
Pobierz darmowy fragment (pdf)
