Cyfroteka.pl

klikaj i czytaj online

Cyfro
Czytomierz
00050 006332 12771810 na godz. na dobę w sumie
Proteomika i metabolomika - ebook/pdf
Proteomika i metabolomika - ebook/pdf
Autor: , , Liczba stron: 580
Wydawca: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego Język publikacji: polski
ISBN: 9788323533399 Data wydania:
Lektor:
Kategoria: ebooki >> edukacja >> chemia
Porównaj ceny (książka, ebook (-16%), audiobook).
Podręcznik dla studentów, doktorantów i pracowników naukowych takich kierunków, jak chemia, biochemia, biotechnologia i medycyna, a także pracowników przemysłu farmaceutycznego oraz firm biotechnologicznych. Proteomika jest nauką zajmującą się badaniem struktury białek oraz zależności między budową danego białka a sprawowaną przez niego funkcją biologiczną. Zagadnienia z zakresu proteomiki obejmują rozdzielanie białek oraz ich sekwencjonowanie z wykorzystaniem nowoczesnych technik badawczych. Istotną część tego podręcznika poświęcono metabolomice nowej dziedzinie badań białek i ich funkcji metabolicznych. Tę pionierską w Polsce prezentację najnowszych gałęzi nauki przygotowano na podstawie ostatnich publikacji i opracowań dostępnych w światowej literaturze przedmiotu. Cennym uzupełnieniem tej książki jest dysk CD, na którym można znaleźć podstawowe dane potrzebne w codziennej pracy w laboratorium, m.in. tabele z zestawem mas aminokwasów i typowych sygnałów pochodzących od zanieczyszczeń próbek. Podano tu również wykaz ważniejszych adresów internetowych w aktywnej postaci, umożliwiających błyskawiczne dotarcie do informacji na temat poszczególnych metod i programów niezbędnych do prowadzenia eksperymentów lub ćwiczeń, a także na połączenie się z rozmaitymi bazami danych. Na CD znajdują się zarazem wszystkie zamieszczone w książce ilustracje, a znakomita ich część prezentowana jest w wersji kolorowej, co pozwala na śledzenie ich na bieżąco podczas lektury książki lub wykorzystywanie podczas zajęć dzięki rzutnikom multimedialnym w dużym powiększeniu.
Znajdź podobne książki Ostatnio czytane w tej kategorii

Darmowy fragment publikacji:

10 Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 10.1. Wprowadzenie Spektroskopia ramanowska (RS) jest metodą badania przejść pomiędzy pozio- mami energetycznymi cząsteczek, zachodzącymi na skutek nieelastycznego rozproszenia światła. Teoretycznie efekt ten został opisany przez Adolfa Smeka- la w 1923 roku, a w 1928 roku hinduski fizyk Chandrasekhara Venkata Raman potwierdził doświadczalnie jego istnienie, gdy zaobserwował kilka linii widmo- wych o małej intensywności dla monochromatycznego światła rozproszonego na próbce benzenu. Za to odkrycie przyznano mu w 1930 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki. Wynikiem pomiaru próbek z użyciem spektrometru ramanowskiego są widma wyrażające zależność intensywności promieniowania rozproszonego w skali względnych wartości liczb falowych w zakresie energetycznym od 4000 do 0 cm−1. Taka reprezentacja widma ramanowskiego odpowiada energetycznej skali częstości widma absorpcyjnego w podczerwieni, co pozwala na porów- nanie tych komplementarnych względem siebie metod spektroskopowych. Widma oscylacyjne mogą być wykorzystane do identyfikowania związku, ana- lizy ilościowej, badania przemian w reakcjach chemicznych oraz oddziaływania z otoczeniem. U podstaw spektroskopii ramanowskiej leży wzbudzenie rotacji lub oscyla- cji cząsteczki poprzez oświetlenie jej światłem (ν0) z zakresu ultrafioletowego, widzialnego lub bliskiej podczerwieni. W wyniku oddziaływania cząsteczka– fala elektromagnetyczna obserwuje się światło rozproszone o tej samej energii (rozproszenie Rayleigha) oraz dyskretne składowe o liczbie falowej innej niż wzbudzające promieniowanie (rozproszenie Ramana). Na widmie ramanow- skim, symetrycznie względem pasma Rayleigha, widoczne są pasma rama- nowskie, czyli pary linii o częstości równej ν0 ± ν1, gdzie ν1 odpowiada czę- stości przejść pomiędzy oscylacyjnymi poziomami danej cząsteczki. Należy podkreślić, iż wielkość przesunięcia pasm ramanowskich względem pasma ray- leighowskiego nie zależy od częstości promieniowania wzbudzającego, a wynika wyłącznie z właściwości cząsteczek rozpraszających. Pasma ramanowskie pojawiające się przy liczbie falowej mniejszej niż ta dla światła wzbudzającego (n0 – n1), nazywane są pasmami stokesowskimi, a te przy wyższych (n0 – n1) pasmami antystokesowskimi (rys. 10.1). Intensywność rozpraszania Rayleigha Proteomika_7-13.indd 105 1/12/14 12:22:06 AM 106 Proteomika i metabolomika jest około 10–3, a Ramana 10–6–10–7 razy mniejsza od intensywności promieniowa- nia wzbudzającego. Jak wynika z rozkładu Boltzmana, pasma antystokesowskie są mniej intensywne w porównaniu z pasmami stokesowskimi, i z tego powodu zazwyczaj nie są rejestrowane na widmach ramanowskich. Wyjaśnienie zjawiska rozpraszania Ramana można oprzeć na gruncie che- mii kwantowej. Wiadomo, że energia stanów rotacyjnych, oscylacyjnych czy też elektronowych jakiegokolwiek układu molekularnego może przyjmować jedynie wartości dyskretne (kwantowane) i odpowiada stanom stacjonarnym cząsteczki opisanych przez jej funkcję falową Ψ. Rozwiązaniem równania własnego dla sta- nów oscylacyjnych w przybliżeniu harmonicznym jest wyrażenie: Eu = hνe(u + 1-2 ), (10.1) a reguła wyboru pozwala na przejścia pomiędzy sąsiednimi stanami. E1 W h(ν0−νi) hν0 h(ν0+νi) hν0 hν0 hν0 ν = 3 ν = 2 ν = 1 E0 v = 0 W ΔE pasmo Ramana stokesowskie pasmo rayleighowskie pasmo Ramana antystokesowskie — — ν1 0 — ν1 ν— Rys. 10.1. Diagram energetyczny obrazujący przejścia między poziomami oscylacyjnymi towarzyszące rozpraszaniu promieniowania i schematyczne widmo ramanowskie odpowiadające tym przejściom Proteomika_7-13.indd 106 1/12/14 12:22:07 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 107 Uwzględnienie nieharmoniczności powoduje rozszerzenie reguł wyboru o przejścia, dla których ∆ν = ±2, ±3, ... , czego konsekwencją są nadtony. Podejście kwantowe wyraźnie wskazuje, iż promieniowanie jest absorbowane lub emito- wane również w sposób kwantowany, gdyż zachodzi na skutek przejść pomiędzy dwoma stanami energetycznymi cząsteczki. Z mechaniki kwantowej wiadomo, że przejście energetyczne między poziomami jest dozwolone, gdy jego moment przejścia przyjmuje wartości różne od zera: anm = áΨnçaˆ çΨmñ � 0 (10.2) W rozproszeniu Ramana decyduje o tym zmiana polaryzowalności w czasie przejścia ze stanu oscylacyjnego n do m. Podejście kwantowe, jako jedyne, we właściwy sposób opisuje intensywność promieniowania rozproszonego dla przejścia n → m i wykazuje jego zależność od oscylacyjnej liczby kwantowej. Integralna intensywność promieniowania rama- nowskiego jest zależna od czwartej potęgi częstości światła wzbudzającego i kwa- dratu pochodnej polaryzowalności względem danej współrzędnej normalnej i jest wyrażona ogólnie przez zależność: ç aç0 (ν0 ± νosc).çanmç2 (10.3) Wartość intensywności ma istotne znaczenie fizyczne, gdyż określa prawdo- podobieństwo przejść pomiędzy poszczególnymi poziomami dwufotonowego procesu, jakim jest rozproszenie Ramana. Wykorzystując zjawisko spektroskopii Ramana, można badać związki we wszystkich stanach skupienia, tj. gazy, ciecze, roztwory (w tym wodne), pasty, ciała stałe jako proszki mikrokrystaliczne, czy też monokryształy w szerokim przedziale temperatur i ciśnień. Pomiar widm ramanowskich nie wymaga zasto- sowania skomplikowanych procedur przygotowania próbek, jak również nie są konieczne specjalne naczynia pomiarowe. W technikach, gdy nie używa się mikroskopu, badane substancje mogą być umieszczane w kapilarach (najczęściej szklanych) przeźroczystych dla promieniowania wzbudzającego lub bezpośred- nio eksponowane na działanie promieniowania w dowolnie zaprojektowanym naczyńku. Niewątpliwą zaletą spektroskopii ramanowskiej jest możliwość jej sto- sowania dla próbek w roztworach wodnych (szczególnie przydatne dla próbek biologicznych), gdyż mała polaryzowalność wody wyraża się małą intensywno- ścią rozpraszanego światła. Pewnym problemem pomiarów ramanowskich jest występowanie tła fluore- scencyjnego. Usunięcie lub zmniejszenie tego efektu można osiągnąć kilkoma sposobami: • dodając do badanej substancji tzw. wygaszaczy (KBr, NaI, KI), • stosując technikę impulsowego wzbudzania próbki, • wykonując pomiar w antystokesowskiej części widma, • zmieniając długość fali promieniowania wzbudzającego, • oczyszczając próbki z zanieczyszczeń fluorescencyjnych, • naświetlając próbki przed pomiarem. Proteomika_7-13.indd 107 1/12/14 12:22:07 AM 108 Proteomika i metabolomika 10.2. Aparatura Spektrometry ramanowskie dzielą się na dwa podstawowe typy: dyspersyjne (skanujące) i tzw. fourierowskie (oparte na interferometrze). W obu tych typach można wyróżnić następujące elementy budowy: laser, komora pomiarowa, siatka dyfrakcyjna lub interferometr i detektor (rys. 10.2 i 10.3). Intensywność rozpraszania ramanowskiego jest proporcjonalna do stężenia i częstości promieniowania padającego, co oznacza, że najsilniejsze rozpraszanie ramanowskie uzyskujemy stosując do wzbudzeń lasery z zakresu UV, zaś najsłab- sze dla zakresu IR. I = I0 kcl~ ν0 (10.4) Zależy ona również od czwartej potęgi częstości promieniowania padającego ν0, co oznacza, że najsilniejsze rozpraszanie ramanowskie uzyskujemy stosując do wzbudzeń lasery z zakresu UV, zaś najsłabsze dla zakresu IR. 4 ( da dq)2cl Rys. 10.2. Spektrometr FT-ramanowski. Od lewej: detektor germanowy z dewarem na ciekły azot, interferometr, komora pomiarowa, komputer, mikroskop ramanowski Rys. 10.3. Dyspersyjny spektrometr ramanowski. Od lewej: mikroskop konfokalny ze stołem pomiarowym przesuwanym w kierunkach x-y-z Proteomika_7-13.indd 108 1/12/14 12:22:07 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 109 Użycie w spektrometrach fourierowskich laserów Nd:YAG pracujących w zakresie podczerwieni powoduje „ucieczkę” od fluorescencji, ale intensywność światła rozproszonego jest zredukowana w związku ze stosowaniem lasera z zakresu IR. Użycie interferometru powoduje jednak częściową kompensację tego zjawiska. Stosowanie lasera Nd:YAG w spektrometrach fourierowskich stwarza też możliwości detekcji promieniowania rozproszonego. Dla tego zakresu widmowego nie mogą być stosowane wielokanałowe, czułe detektory CCD (używane często w spektrometrach dyspersyjnych), wykorzystuje się nato- miast detektory Ge lub InGaAs, które jednak charakteryzują się większym szu- mem i niższą czułością. Korzyści ze stosowania spektrometrów fourierowskich w stosunku do dys- persyjnych to: • korzyść Connesa: optyczna kontrola przesuwu zwierciadła, wysoka pre- cyzja skali częstości widma, dzięki stosowaniu lasera (He i Ne) jako wzorca częstości, • korzyść Fellgetta (zysk multipleksowy): zbieranie wszystkich długości fal w tym samym czasie, skrócenie czasu pomiaru i poprawa stosunku sygnału (S) do szumu (t), gdyż: ( ), n – liczba pomiarów S/N~n1-2 (10.5) • korzyść Jacquinota: brak szczelin ograniczających wiązkę promieniowania, a więc możliwość rejestracji całego widma w tym samym czasie, • zmiana rozdzielczości widma jest prosta i szybka – dokonywana przez zmianę w programie komputerowym, zaś w spektrometrach dyspersyjnych wymaga zmiany siatki dyfrakcyjnej i rekalibracji aparatu. 10.3. Wprowadzenie do analizy aminokwasów, białek i metabolitów Spektroskopię ramanowską wykorzystuje się do badania zarówno pierwszo-, jak i drugorzędowej struktury białek. W przypadku struktury pierwszorzędowej może być wykorzystana do stwierdzenia obecności w białku pewnych amino- kwasów (np. aromatycznych oraz cysteiny) i nie nadaje się do analizy sekwencji łańcucha. Natomiast w pełni jest wykorzystywana do określenia procentowego udziału struktur helikalnej (a), typu β i nieuporządkowanej oraz śledzenia ich zmian w różnych warunkach fizykochemicznych. W pośredni sposób RS można również stosować do analizy wyższych struktur białek oraz lokalnych zmian w niektórych aminokwasach. Atomy tworzące wiązanie peptydowe dają w widmie pasma amidowe nazwane, odpowiednio: A, B, I–VII. Pasma, które wyróżniają widmo polipep- tydowe od mieszaniny aminokwasów w spektroskopii ramanowskiej, to przed wszystkim drgania amidowe: • amid I – drganie rozciągające C=O i wahadłowe N–H • amid II – drganie rozciągające C–N i zginające N–H • amid III – drganie rozciągające C–N i deformacyjne N–H Proteomika_7-13.indd 109 1/12/14 12:22:07 AM 110 Proteomika i metabolomika Spośród tych drgań do określenia struktury drugorzędowej w spektroskopii ramanowskiej wykorzystuje się drgania amidowe I i III (rys. 10.4 i 10.5), natomiast drganie II jest widoczne w spektroskopii UV RRS omówionej niżej. Określenie struktury II-rzędowej za pomocą częstości pasm nie jest tak dokładne, jak za pomocą krystalografii lub pomiarów CD, ale pozwala wyznaczyć ogólną tendencję. Tworzenie wiązań wodorowych C=O…H–N przesuwa drganie amidowe I w dół, a amidowe III – w górę skali częstości. Dla poliglicyny mającej strukturę β wynoszą one odpowiednio: drganie amid I: 1685–1630 cm−1, amid III: 1297 cm−1, zaś dla poliglicyny o strukturze a, odpo- wiednio: 1641 cm−1 oraz 1309 cm−1. Przykładowe dane dla glukagonu podano w tabeli 10.1. Na podstawie przeprowadzonych badań przewidziano położenia pasm amidu I dla różnych struktur II-rzędowych. W widmie struktury helikalnej z podwójnym wiązaniem wodorowym występuje pasmo przy 1642 cm−1, w wid- mie analogicznej struktury z pojedynczym wiązaniem wodorowym występuje pasmo przy częstości 1658 cm−1 oraz słabsze pasmo przy 1682 cm−1. Częstość Rys. 10.4. Drgania amidowe, kolejno od lewej: amid I, amid II i amid III I a k s w o n a m a r ć ś o n w y s n e t n I - r t s S S 8 0 5 r t s C - α C 9 3 9 e h P 0 0 0 1 e h P 0 3 0 1 r y T 1 3 8 r y T 0 5 p 8 r T 0 5 7 - r t s S C 7 6 6 e h P 0 2 6 r y T 3 4 6 f e d H C 7 4 4 1 f e d H - α C p r T 1 4 3 1 p r T 1 4 3 1 i e d m A 6 5 6 1 e h P 9 0 6 1 p r T , e h P 2 8 5 1 α I I I i e d m A 2 4 2 1 β I I I i e d m A 2 4 2 1 r y T , e h P 5 0 2 1 r y T 4 7 1 1 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Rys. 10.5. Widmo ramanowskie białka: obok pasm charakterystycznych dla aminokwasów występują pasma amidowe I i III Liczba falowa [cm–1] Proteomika_7-13.indd 110 1/12/14 12:22:08 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 111 Tabela 10.1. Częstości drgań glukagonu w zależności od struktury II-rzędowej (w cm−1) Glukagon Rodzaj drgania amidowe I amidowe III a-helisa stuktura β struktura nieregularna a-helisa stuktura β struktura nieregularna Forma krystaliczna Żel Roztwór kwaśny 1658 1672 1266 1232 1248 pasma dla antyrównoległej struktury β wynosi 1675 cm−1, dla równoległej struk- tury β – 1671 cm−1, dla zwrotnej struktury β 1655 cm−1 (I typu – 1640–1690 cm−1, II typu – 1660–1665 cm−1), z dodatkowym słabym pasmem przy 1685–1690 cm−1, oraz dla nieuporządkowanej między 1650–1660 cm−1 i pasmo jest szerokie. Jeśli chodzi o najbardziej typowe położenia pasm charakteryzujących strukturę dru- gorzędową w zakresie pasm amidowych i drgań szkieletowych (rozciągających) łańcucha polipeptydowego, to pasma amidu III dla struktury helikalnej wystę- pują w zakresie 1264–1300 cm−1, dla struktury β w zakresie 1230–1243 cm−1, a dla nieregularne przy około 1243 cm−1. W trakcie traktowania deuterem, drganie amidowe III zanika z powodu pod- stawienia N-D, natomiast drganie I przesuwa się w stronę niższych częstości o około 5 cm−1. Występujący w widmach Ramana zakres pasm związany z drganiami roz- ciągającymi C-C między 890–950 cm−1 charakteryzuje także strukturę drugorzę- dową. Pasmo struktur helikalnych występuje przy częstości około 930 cm−1, a jego intensywność maleje w miarę powstawania struktury β, czy nieregularnej. Dla tej ostatniej pasmo to leży przy 950–970 cm−1. Pasmo przypisywane strukturze β obserwowano także w zakresie 1020–1060 cm−1. 10.3.1.Tryptofan Pasma tryptofanu są czułe na mikrośrodowisko reszty aminokwasowej: sto- sunek intensywności pasm przy 1360 i 1340 cm−1 (dublet tryptofanowy) I1360/ I1340 jest związany ze środowiskiem hydrofobowym/hydrofilowym, w którym znajduje się reszta tryptofanowa (większa wartość występuje dla środowiska hydrofobowego). 10.3.2. Tyrozyna Pasma pochodzące od drgań reszty aminokwasowej tyrozyny są czułe na obec- ność wiązań wodorowych. Około 860 cm−1 i 833 cm−1 pojawiają się dwa pasma, których stosunek intensywności (I860/I833) wynosi około 2,5, gdy grupa OH jest akceptorem w silnym wiązaniu wodorowym, lub około 0,3, gdy jest donorem Proteomika_7-13.indd 111 1/12/14 12:22:08 AM 112 Proteomika i metabolomika w silnym wiązaniu wodorowym. Jeśli w białku obecne są więcej niż 2 reszty tyro- zynowe, pasma ramanowskie są średnią ze wszystkich reszt. 10.3.3. Histydyna Pasma histydyny w widmie ramanowskim są wskaźnikiem protonacji jej reszty aminokwasowej. Przy 1408 cm−1 w D2O są zauważalne silne i wąskie pasma dla sprotonowanej histydyny. Pasmo to przypisuje się drganiom symetrycznym, roz- ciągającym N1-C2-N3 i zginającym N-D. Drganie rozciągające C4 = C5 w pH obojętnym pojawia się przy 1574–1587 cm−1, natomiast gdy nastąpi związanie z jonem metalu, np. Cu(II), czy Zn(II), pasmo to przesuwa się. Nowa częstość pasma zależy od miejsca przyłączenia metalu: Nπ czy NT. Efekt ten wykorzystuje się do analizy struktury metalicznie indukowanej agregacji peptydów beta-amyloidu w nierozpuszczalnych fibrylach, które wystę- pują w chorobie Alzheimera. 10.3.4. Drgania mostka disiarczkowego Mostek disiarczkowy pełni kluczową rolę w strukturze III-rzędowej białek. Widmo ramanowskie mostka S–S jest wrażliwe na jego konformację, dzięki czemu można określić strukturę białka za pomocą RS. Obecne są w widmie przede wszystkim dwa drgania: rozciągające S–S (vs-s) i rozciągające C–S (vC-S), obydwa zależące od kąta dwuściennego C–C–S–S–C–C. Drganie vs-s pojawia się około 508–512 cm−1 dla konformacji GGG, 523–528 cm−1 dla TGG i 540–545 cm−1 dla TGT (T – trans, G – gauche). Warto zauważyć, że spektroskopia ramanowska jest jedną z nielicznych metod umożliwiających badanie mostków disiarczko- wych w roztworach. 10.3.5. Metionina i cysteina Cysteina i metionina zawierają ugrupowanie –C–S–, których drganie rozciąga- jące daje pasma vC-S około 630–750 cm−1. Dodatkowo po utlenianiu metioniny za pomocą H2O2, przy 1010 cm−1 i 704 cm−1 pojawiają się pasma przypisywane drga- niom rozciągającym S=O i C–S sulfotlenku metioniny. Pasma te są dość inten- sywne i mogą służyć jako wskaźniki degradacji białka. Jako przykład wykorzystania RS w analizie mogą służyć badania u pacjen- tów chorych na bielactwo nabyte. W trakcie tej choroby w białkach naskórka następują reakcje utlenienia metioniny do pochodnej tlenku siarki i siarczanu, a także cysteiny do kwasu cysteinowego oraz l-tryptofanu do 5-OH-Trp, N-for- mylokinureniny i kinureniny. Badania prowadzone in vivo pozwoliły na bez- pośrednią detekcję zachodzących zmian oraz tych związków w naskórku pacjentów. Proteomika_7-13.indd 112 1/12/14 12:22:08 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 113 10.4. Specjalne techniki ramanowskie w proteomice i metabolomice Zwykła (klasyczna) spektroskopia ramanowska, ze względu na stosunkowo nie- wielką czułość i selektywność, ma ograniczone zastosowanie do badań związ- ków występujących w małych stężeniach lub w obecności innych komponentów. Z powodzeniem jednak stosuje się specjalne techniki, które czynią ze spektro- skopii ramanowskiej nie tylko wysokoselektywną i wysokorozdzielczą metodę analityczną, ale też umożliwiają badania dodatkowych właściwości cząsteczek (tj. np. aktywność optyczna), czy też rozkład substancji w wybranych przekrojach próbki. Na potrzeby tego opracowania omówiono te, które szczególnie dotyczą zagadnień bioanalitycznych. 10.4.1. Rezonansowe rozpraszanie ramanowskie, RRS Rezonansowa spektroskopia ramanowska (RRS, ang. resonance Raman spectroscopy) jest szczególną odmianą klasycznej spektroskopii ramanowskiej. Polega ona na rejestracji widma przy użyciu lasera o długości fali leżącej w zakresie przejścia elektronowego analizowanego związku, co oznacza, że w praktyce wykorzysty- wana jest dla substancji zawierających ugrupowania chromoforowe (rys. 10.6). Główną cechą efektu RRS jest dodatkowe, selektywne wzmocnienie pasm pochodzących od drgań atomów wchodzących w skład fragmentu chromoforo- wego. Pozwala to na zwiększenie czułości metody i zmniejszenie stężenia badanej Rys. 10.6. Diagram energetyczny obrazujący przejścia między poziomami oscylacyjnymi towarzyszące rezonansowemu rozpraszaniu promieniowania Proteomika_7-13.indd 113 1/12/14 12:22:09 AM 114 Proteomika i metabolomika substancji do wartości 10−5–10−7 mol/dm3. Umożliwia również zidentyfikowanie pasm chromoforowych pochodzących od konkretnego fragmentu cząsteczki w bardzo złożonym zazwyczaj układzie biologicznym. Użycie laserów barwniko- wych pozwala na dokładne dopasowanie linii wzbudzającej do odpowiedniego pasma absorpcyjnego związanego z konkretnym fragmentem cząsteczki. Obecnie ten rodzaj spektroskopii ramanowskiej stosuje się często w zestawie- niu z innymi technikami, np. SERS (SERRS). 10.4.2. Rezonansowa spektroskopia ramanowska białek zakresu UV W ostatnim czasie coraz częściej do analizy białek stosuje się rezonansową spek- troskopię ramanowską z zakresu UV (UV RRS, ang. UV resonance Raman spectro- scopy). Ponieważ światło z zakresu UV (250–200 nm) przypada na zakres absorpcji aminokwasów aromatycznych i szkieletu polipeptydowego, pozwala to na selek- tywne wzmocnienie sygnału od tych fragmentów i uzyskanie szczegółowej infor- macji na temat konformacji białka. 10.4.2.1. Drgania amidowe II drganie amidowe, składające się ze sprzężonych drgań N–H i C–N, zwykle jest zbyt słabe w klasycznej RS, aby służyć do identyfikacji struktury, lecz może być obserwowane w UV RRS. Jego intensywność wzrasta wraz ze wzrostem zawarto- ści struktury a-helikalnej. 10.4.2.2. Drgania aminokwasów aromatycznych W spektroskopii UV RRS szczególnie dobrze są wzmacniane pasma od aroma- tycznych reszt aminokwasowych. Podobnie jak w RS, położenie poszczególnych drgań i ich ewentualne przesunięcie jest związane ze środowiskiem, w którym znajduje się reszta aminokwasowa, a szczególny wpływ ma tworzenie wiązań wodorowych. Na przykład w widmie HbA, pasmo przy 1511 cm−1, które jest przypisywane do Trp, w D2O jest przesunięte 5 cm−1 w stronę wyższych częstości. Pasmo to może być wykorzystywane jako ilościowy wskaźnik HbA (hemoglobiny A), okre- ślający strukturę wyższych rzędów. 10.4.2.3. Drgania związane z cysteiną W UV RRS można także obserwować drganie rozciągające S–H bocznego łańcu- cha cysteiny. Jego częstość jest czuła na wiązanie wodorowe – pojawia się przy 2525–2560 cm−1, 2560–2575 cm−1 lub przy 2572–2580 cm−1, odpowiednio, dla sil- nego, średniego i słabego wiązania wodorowego. Drganie to jest również wraż- liwe na skręcenia kąta torsyjnego bocznego łańcucha wokół wiązania Ca–Cβ. 10.4.3. Widzialna rezonansowa spektroskopia ramanowska białek Ten rodzaj spektroskopii (visRRS, ang. visible resonance Raman spectroscopy) stosuje się często do badania zależności pomiędzy strukturą a funkcją wielu pigmen- tów biologicznych. W szczególności często wykorzystuje się ją do analizy białek hemowych. Proteomika_7-13.indd 114 1/12/14 12:22:09 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 115 hem hem 0,15 j a c n a b r o s b A 0,10 0,05 hem hem 0,00 200 300 400 500 600 Długość fali [nm] 700 800 Rys. 10.7. Struktura białka hemowego wraz z widmem absorpcyjnym UV-VIS 10.4.3.1. Białka hemowe Jak wspomniano wyżej, główną cechą efektu RRS jest selektywne wzmocnienie pasm pochodzących od drgań atomów wchodzących w skład fragmentu chromoforowego. Poniżej przedstawiono przy- kład selektywnego wzbudzania białka hemowego w zakresie 418 i 230 nm (patrz na widmo absorp- cyjne UV-VIS zamieszczone obok struktury białka, rys. 10.7). Pierwsze wzbudzenie pozwala na uzy- skanie informacji na temat grup hemowych, drugie zaś – reszt aminokwasowych w części białkowej: tyrozyny (Tyr) i tryptofanu (Trp) (rys. 10.8). VisRRS stosuje się do analizy ligandowych wią- zań białek hemowych oraz do badania interakcji pomiędzy ligandem wewnętrznym i żelazem hemo- wym, a także pomiędzy ligandem zewnętrznym i żelazem lub bliskim fragmentem białka. Widma visRRS w zakresie wysokich częstości, gdzie poja- wiają się drgania szkieletowe pierścienia porfiryno- wego, odzwierciedlają stan utlenienia, liczbę koor- dynacyjną i spin żelaza hemowego. Na przykład pasmo v4 przy 1370–1375 cm−1 oraz pasmo przy 1355–1362 cm−1, odpowiednio dla Fe(III) i Fe(II), służą jako markery stanu utlenienia. Drganie rozciągające vFe-O2 pojawia się w oksy- hemoglobinie przy około 567 cm–1 i przesuwa się do 540 cm–1 dla kompleksu z 18O2. Drgania vFe-O2 obserwuje się nie tylko dla oksyhemoglobiny, ale dla różnych białek hemowych. Obecne są w nich drgania nie tylko vFe-O2 rozciągające, ale również hemoglobina wzbudzenie = 418 nm 1000 1200 – v [cm–1] 1400 1600 hemoglobina wzbudzenie = 230 nm 1000 1200 – v [cm–1] 1400 1600 Rys. 10.8. Widma ramanowskie białka hemowego otrzymane przy wzbudzeniu 418 i 230 nm. Widma są całkowicie różne z powodu wzmocnienia rezonansowego Proteomika_7-13.indd 115 1/12/14 12:22:10 AM 116 Proteomika i metabolomika zginające Fe-O-O (δFeOO). Interesujące jest to, że vFe-O2 ma podobną wartość dla Mb, Hb, CcO, cytochromu bo i oksygenazy hemowej HO, mimo że funkcja tych białek jest całkowicie odmienna. 10.4.3.2. Białka miedziowe Ten rodzaj białek jest intensywnie badany za pomocą visRRS. Zwłaszcza niebieskie białka miedziowe typu I można łatwo analizować dzięki silnemu pasmu absorpcji przy około 600 nm. Z kolei dla plastocyjanin izolowanych z różnych źródeł, po wzbudzeniu laserem o długości fali około 600 nm widoczne są pasma w regio- nie 300–500 cm−1. Pasma te przypisuje się głównie drganiom rozciągającym Cu–S oraz drganiom wewnętrznym skoordynowanego łańcucha bocznego Cys. Drganie vCu-S służy jako czuły wskaźnik siły wiązania Cu–S (Cys) i geometrii skoordynowania miedzi w białku. 10.4.3.3. Drgania chinonowe Chinony odgrywają ważną rolę ze względu na łatwe przejście redoksowe pomię- dzy strukturą chinonową i chinolową. W szczególności rolą chinonów jest sprzę- żenie transferu elektronów z translokacją protonów w membranach. Zhaoal. i in. badali ten proces za pomocą spektroskopii visRR u bichinonów w centrach foto- syntetycznej reakcji bakterii. 10.4.3.4. Drgania rodników tyrozyny w białkach Rodniki tyrozyny wykryto jako półprodukty reakcji oksydaz zawierających miedź, tj. galaktozooksydazy i glioksalooksydazy. Związki te mają silne pasmo absorpcji przy około 450 i 800–850 nm. Widmo ramanowskie aktywnej galak- tozooksydazy i glioksalooksydazy otrzymane przy użyciu światła laserowego o długości około 450 nm pokazuje drganie rozciągające C–O reszty Tyr przy 1487 cm−1. Z kolei drgania rozciągające C–O rodników fenolowych i fenoksylo- wych pojawiają się, odpowiednio, przy 1265 i 1505 cm−1. 10.4.3.5. Flawoproteiny Ten rodzaj białek jest szczególnie ważny jako redoksyenzymy. Ponieważ fla- winy wykazują zwykle dużą fluorescencję w stanie utlenionym, trudno zmie- rzyć widmo RR flawoprotein. W specjalnych warunkach fluorescencja może być wygaszona i pomiar RR staje się możliwy. Pierwsze rezonansowe widmo utle- nionej flawoproteiny obserwowano dla ryboflawiny. Pasma na widmie visRRS flawin przypisano do poszczególnych drgań na podstawie danych pochodzących z widma dla izotopowo znaczonego pierścienia izoalloksazynowego. 10.4.4. Powierzchniowe wzmocnienie rozpraszania Ramana, SERS Jednym z ograniczeń klasycznego rozpraszania ramanowskiego jest słaba inten- sywność sygnału, a tym samym mała czułość metody w badaniach roztworów. W latach 70. ubiegłego wieku zauważono jednak, że wzbudzenie ramanowskie może być wzmocnione nawet 106-krotnie, jeśli cząsteczka zostanie zaadsorbo- wana lub jest w bliskiej odległości od specjalnie przygotowanej powierzchni metalicznej (Ag, Au, lub Cu). Technika związana z tym zjawiskiem jest znana jako Proteomika_7-13.indd 116 1/12/14 12:22:10 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 117 powierzchniowe wzmocnienie rozpraszania Ramana (SERS, ang. surface enhan- ced Raman spectroscopy). Dodatkowo, w przypadku rejestracji widma przy użyciu lasera o długości fali bliskiej elektronowej absorpcji badanej próbki, sygnał jest wzmocniony w sposób rezonansowy i wówczas technika nosi nazwę SERRS (ang. surface enhanced resonance Raman spectroscopy). Doniesienia literaturowe świad- czą o tym, że SERS (SERRS) umożliwia obserwację nawet pojedynczej cząsteczki (SMD, ang. single molecule detection), czego jak dotąd inne metody spektroskopowe nie oferują. Zaletą techniki SERS jest też wysoki poziom specyficzności pomiędzy analizowaną substancją a powierzchnią metalu oraz jednoczesna detekcja wielu składników na poziomie śladowym. Mechanizm wzmocnienia SERS jest związany z dwoma zjawiskami: elektro- magnetycznym i chemicznym. Pierwsze z nich pojawia się na skutek wzmocnienia pola elektromagnetycznego w wyniku wzbudzenia plazmonów na powierzchni metalicznej padającym promieniowaniem laserowym i jego działanie ma charak- ter dalekozasięgowy. To znaczy, że pojawia się wzmocnione rozpraszanie rama- nowskie pochodzące od cząsteczek znajdujących się nawet do 10 Å od powierzchni metalu. Drugi mechanizm wymaga bliskiego kontaktu cząsteczki z powierzch- nią metalu i wymiany elektronu pomiędzy nimi. Nazywany jest mechanizmem z przeniesieniem ładunku (CT, ang. charge transfer). Jako powierzchnia metaliczna służyć mogą nanocząstki koloidalne, elektrody, filmy lub wyspy srebra i złota (rys. 10.9). Z powodu prostoty przygotowania, najczęściej wykorzystuje się koloidy sre- bra lub złota (o pH 6,5–8), do których dodaje się niewielką ilość wodnego (i nie tylko) roztworu analizowanej substancji (do kilku µL) o stężeniu 10−2–10−10 M. Rys. 10.9. Schemat obrazujący metodykę SERS Proteomika_7-13.indd 117 1/12/14 12:22:11 AM 118 Proteomika i metabolomika Dostępne są również płytki z przygotowanym już nanochipem srebra. Widma mierzy się przy użyciu lasera z zakresu VIS-NIR. Metoda SERS pozwala też na określenie orientacji zaadsorbowanej cząsteczki i mechanizmu oddziaływania z powierzchnią substratu (metalu). Analiza widm SERS jest oparta na wzmocnieniu drgań pochodzących z tych fragmentów czą- steczki, które oddziałują z powierzchnią, a zatem, w porównaniu z normalnym widmem ramanowskim, widoczne są tylko niektóre pasma. Spektrometr ramanowski sprzężony z mikroskopem konfokalnym pozwala na wykrycie białek komórkowych w sposób niedestrukcyjny w pojedynczych komórkach. W tym celu wykorzystuje się związki chemiczne wykazujące wysoką aktywność ramanowską i dające wyraźne pasma na widmach ramanowskich jako potencjalne markery. Związki te, sprzężone następnie z cząsteczkami biologicz- nymi, mogą być wykorzystane do detekcji enzymów bądź receptorów komórko- wych. Dodatkowy wzrost intensywności rozpraszania ramanowskiego takich układów obserwowano po dodaniu srebra koloidalnego. SERS stosuje się do analizy jakościowej leków, glukozy, sekwencjonowania DNA i białek badanych w ich naturalnym stanie występowania. Technikę tę wykorzystuje się do analizy wieloskładnikowych próbek biologicznych, jako spe- cyficzną sondę do badań leków oraz ich oddziaływań z różnymi makrocząstecz- kami, takimi jak proteiny czy kwasy nukleinowe. Badania te prowadzi się w celu poznania i zrozumienia mechanizmów działania danej grupy farmaceutyków na poziomie komórkowym i zastosowania tej wiedzy do syntezy i charakterystyki cząsteczek o potencjalnym wpływie terapeutycznym. Tego typu podejście do badań leków metodą SERS jest dość powszechne w literaturze. Widma SERS wykorzystuje się do badania mechanizmu tworzenia wiązania ligand–receptor, co jest szczególnie ważne w określeniu struktury kompleksu lek– proteina. Są też próby wykorzystywania SARS do analiz ilościowych. Wykazano, że SERS może być metodą analityczną wyznaczającą stężenia glukozy, triacylogli- ceroli, cholesterolu, białek, HDL, LDL, mocznika i kwasu moczowego w surowicy krwi w zakresie klinicznym. Spektroskopia SERS umożliwia również w pewnych przypadkach rozróż- nienie enancjomerów związków optycznie czynnych. Takim przykładem są leki z grupy β-brokerów. Badania SERS nad propranololem, alprenololem, acebuto- lolem i atenololem wskazały na obecność pasm markerowych pozwalających na rozróżnienie poszczególnych enancjomerów i mieszaniny racemicznej w prób- kach o stężeniu 50 µg/ml. 10.4.5. Ramanowska aktywność optyczna, ROA Substancje czynne optycznie po wzbudzeniu promieniowaniem spolaryzowa- nym wykazują różną prędkość propagacji składowych promieniowania kołowo spolaryzowanych lewo- i prawoskrętnie. W wyniku tego następuje skręcenie płaszczyzny polaryzacji promieniowania rozproszonego. Techniką ramanowską służącą do określenia chiralności cząsteczek jest spektroskopia ROA (ang. Raman optical activity). Pomiar ramanowskiej aktywności optycznej polega na określeniu różnicy w rozpraszaniu nieelastycznym przez substancję chiralną światła spola- ryzowanego kołowo – w lewo i w prawo. Na podstawie różnicy w intensywności Proteomika_7-13.indd 118 1/12/14 12:22:11 AM 10. Spektroskopia ramanowska w badaniach białek – porównanie technik 119 widm ramanowskich dla różnej polaryzacji światła padającego (czyli z sygnału ROA) można badać strukturę związków czynnych biologicznie. Możliwe jest też określenie absolutnej konfiguracji cząsteczki, co jest szczególnie istotne, gdy inne metody wyznaczenia konfiguracji zawodzą (na przykład metody dyfrakcyjne dla substancji niekrystalizujących). Ponieważ zdecydowana większość biomo- lekuł i biopolimerów ma budowę chiralną, przed spektroskopią ROA otwierają się fascynujące perspektywy aplikacji na polu biofizyki molekularnej, bioche- mii i biologii strukturalnej. Jako że widmo oscylacyjne jest z natury bogatsze w sygnały niż widmo elektronowe, spektroskopia ROA jest potencjalnie nawet bardziej obiecującą metodą badawczą niż szerzej znana spektroskopia elektrono- wego dichroizmu kołowego (CD). Widma ROA są bardzo słabe (widmo różnicowe jest około 1000 razy słabsze niż zwykłe widmo Ramana), dlatego spektroskopia ta rozwija się od stosunkowo niedawna. Jednym z najważniejszych obszarów zastosowań ROA są badania typu zwi- nięcia białek oraz struktury i dynamiki kwasów nukleinowych. Zastosowanie ROA w biofizyce molekularnej daje możliwość charakteryzo- wania przejściowych stanów konformacyjnych białek zarówno z punktu widze- nia podstawowych motywów II-rzędowych, jak i ich upakowania przestrzennego. Co bardzo istotne, spektroskopia ROA pozwala na badanie dynamiki szybko fluk- tuujących, i przez to słabo ustrukturyzowanych konformacji polipeptydów, które nie są widoczne w wysokorozdzielczej spektroskopii NMR. Fakt, iż właśnie takie konformacje są postrzegane jako odgrywające główną rolę w genezie cytotok- syczności nieprawidłowo zwiniętych białek (ang. misfolded protein conformations), czyni z ROA jedną z najbardziej atrakcyjnych metodologii w badaniach nad mole- kularnymi mechanizmami chorób konformacyjnych, m.in. choroby Alzheimera, Parkinsona czy Creutzfeldta–Jakoba – choroby prionowej. Ważnym atutem ROA jest jej zdolność do jednoczesnego badania struktur bia- łek i kwasów nukleinowych w ich wielkocząsteczkowych i często nie krystalizu- jących kompleksach, tj. w wirusach. Ten problem, bardzo trudny z punktu widze- nia biologii, a zwłaszcza proteomiki strukturalnej, nie pozwala na zastosowanie technik dyfrakcji promieni X, ani – ze względu na masę cząsteczkową wirusów – wysokorozdzielczej spektroskopii NMR. Czułość chiroptycznej spektroskopii ROA na łamanie symetrii strukturalnej jest z jednej strony narzędziem badania dryftu konformacyjnego w białkach kapsydów wirusowych, z drugiej zaś – poprzez cha- rakteryzowanie subtelnych zmian struktury tych białek – ROA może być pomocna w projektowaniu nowych molekularnych strategii antywirusowych. Sygnał ROA charakteryzuje się słabą intensywnością, co może w pewnych przypadkach utrudniać detekcję właściwości chiralnych cząsteczek o małym stę- żeniu. Jednak połączenie tej metody ze wzmocnieniem powierzchniowym rozpra- szania ramanowskiego pozwala obniżyć poziom detekcji. Tego typu metoda nosi nazwę SEROA (ang. surface enhanced Raman optical activity). Pomiary przeprowadza się na spektrometrze ROA, a różnicą jest sposób przygotowania próbki do badań. Należy badaną substancję umieścić w koloidzie srebra lub złota, tak jak w typo- wych pomiarach SERS. Na przykład, widmo SEROA dla cytydyny zmierzono przy stężeniu µM, a mioglobiny czy cytochromu c – nawet dla stężeń 10−7 M. W tym ostatnim przypadku sygnał ROA został dodatkowo wzmocniony przez efekt rezo- nansowy (SERROA). Technika SEROA/SERROA pozwala również na obserwację Proteomika_7-13.indd 119 1/12/14 12:22:11 AM 120 Proteomika i metabolomika mechanizmu przyłączania ligandu do białka, jak wykazano na przykładzie połą- czenia mioglobiny z azydkami – niewielkimi strukturalnie cząsteczkami. Widmo rezonansowego rozpraszania Ramana, zwykle wykorzystywane w tego typu bada- niach, nie wykazało żadnych zmian spektralnych, sugerując brak oddziaływania. Natomiast widma SERROA ujawniły zmiany położeń pasm i ich intensywności charakterystycznych dla pierścienia porfirynowego, co jednoznacznie wykazuje czułość tej metody nawet na niewielkie zmiany strukturalne. 10.5. Mapowanie ramanowskie, RM pasmo Rayleigha A B C _ ∆ν [cm−1] ć ś o n w y s n e t n I o g e n o z s o r p z o r . m o r p V0 C B B C A konwencjonalny obraz mapy ramanowskie Rys. 10.10. Tworzenie map romanowskich obrazujących rozkład pojedynczych składników A, B i C na podstawie charakterystycznych pasm dla tych substancji. (Zaadaptowane z: Dhamelincourt, 2002) Znacznie więcej informacji o badanym układzie dostarcza, ostatnio inten- sywnie rozwijana, technika mapowa- nia ramanowskiego, która pozwala zbierać informacje o rozkładzie prze- strzennym badanego związku bez- pośrednio w tkankach czy komór- kach. Rozmieszczenie wybranych związków w przekrojach próbki jest obrazowanie rozkładem intensyw- ności ich sygnałów ramanowskich w badanym przekroju. Pozwala to na otrzymanie 2-wymiarowych obrazów przedstawiających rozkład pojedyn- czych składników w złożonych ukła- dach biologicznych (rys. 10.10). Powszechnie są znane i stoso- wane trzy techniki mapowania ra - manowskiego: punktowa, liniowa powierzchniowa (rys. 10.11). W wyniku mapowania seryj- nego, czyli techniką punktową lub liniową, otrzymuje się zbiór widm, z którego konstruowana jest mapa Rys. 10.11. Techniki mapowania ramanowskiego, od lewej: punktowa, liniowa i powierzchniowa Proteomika_7-13.indd 120 1/12/14 12:22:11 AM 121 Rys. 10.12. Od lewej: fotografia bratka; mapa rozdziału karotenów (integracja ~1156 cm–1); mapa rozdziału antocyjanów (intensywność pasma ~ 1260 cm–1); mapa rozdziału glikozydów flawonolowych (intensywność pasma ~ 1570 cm–1) (kolor p. dysk CD) ramanowska. Mapowanie powierzchniowe polega natomiast na bezpośrednim naświetleniu określonego obszaru próbki. W tym przypadku za pomocą odpo- wiednio przestrajalnych filtrów wybiera się pewien zakres długości fali promie- niowania rozproszonego, które jest rejestrowane przez detektor. Prowadzi to do otrzymania zbioru obrazów, z których można rekonstruować poszczególne widma ramanowskie. Na przykładzie kwiatu bratka pokazano, że zastosowanie mapowania rama- nowskiego umożliwia nie tylko identyfikację głównych barwników bezpo- średnio w żywej tkance płatka, ale też zbadanie ich ewentualnej kopigmentacji (rys. 10.12.) Dodatkowe sprzężenie spektrometru z mikroskopem sił atomowych pozwala na prowadzenie badań z rozdzielczością poniżej 1 mikrometra (przy wzbudze- niu linią 532 rozdzielczość wynosi 200 nm!), a dzięki wprowadzeniu mikroskopii konfokalnej można oglądać przekroje poprzeczne poszczególnych fragmentów tkanek, a zatem dokonywać 3-wymiarowgo mapowania próbki. Spektroskopię ramanowską można stosować do badania tkanek roślinnych i zwierzęcych zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro. A więc np. widma ramanowskie wykonane in vitro ze ściany tętnicy wieńcowej człowieka z płytką miażdżycową bez ognisk zwapnienia wskazują jednoznacznie na wysoką zawar- tość cholesterolu, protein i (fosfo)lipidów oraz małe stężenie soli wapnia w miej- scu analizy, podczas gdy pomiar zaawansowanej płytki miażdżycowej zawierają- cej ogniska zwapnienia wykazuje odwróconą skalę stężeń wymienionych wyżej składników. Mikroskopia ramanowska pozwala też na niedestrukcyjne badania lipopro- tein bogatych w triacyloglicerole (TGRL), zarówno ich składu, jak i rozmiesz- czenia. Można określić stopień nienasycenia kwasów tłuszczowych oraz dyna- mikę metabolizmu poszczególnych cząsteczek TGRL w oddziaływaniu z lipazą lipoproteinową, która jest zlokalizowana na powierzchni komórek śródbłonka i odgrywa podstawową rolę w regulacji poziomu triacylogliceroliwe krwi, zwłasz- cza po posiłku. Wykorzystanie spektroskopii ramanowskiej może więc również umożliwiać badania mechanizmów działania leków obniżających stężenie triacy- logliceroli we krwi. W tabeli 10.2 przedstawiono zestawienie technik ramanowskich. Proteomika_7-13.indd 121 1/12/14 12:22:11 AM 122 Proteomika i metabolomika Tabela 10.2. Zestawienie technik ramanowskich Charakterystyka Spektrometr RS FT-rama- nowski lub dyspersyjny Technika RR dyspersyjny SERS FT-ramanowski lub dyspersyjny ROA przystosowany do pomiaru aktywności optycznej Przedmiot badań uśredniony stan całej cząsteczki grupy chromoforowe grupy, których drgania leżą w płaszczyźnie prostopadłej do powierzchni cząsteczki aktywne optycznie Rozdzielczość zależy od długości linii wzbudzającej, rzędu 0,2–kilka µm Problemy fluorescencja fluorescencja rozpuszczalność mała czułość, długie pomiary Próbki Współczynnik depolaryzacji ciała stałe: wielkość µg roztwory: ~1 M 0–3/4 ciała stałe: wielkość µg roztwory: 10-5–10–7 M 0–∞ Zagadnienia RM FT-rama- nowski lub dyspersyjny, z przystawką do mapo- wania dystrybucja wybranych związków długie pomiary techniką punktową ciała stałe o płaskiej powierzchni roztwory: 10–2–10–10 M roztwory: ~1 M – – – 1. Wyjaśnij oddziaływanie promieniowania z oscylującymi cząsteczkami. Opis przejść pomiędzy poziomami energetycznymi towarzyszącymi rozpraszaniu ramanowskiemu. 2. Podaj wykorzystanie spektroskopii ramanowskiej do badania struktury 3. Omów rezonansową spektroskopię ramanowską w badaniach białek hemowych. 4. Opisz technikę SERS oraz jej zalety w stosunku do normalnego rozpraszania 5. Opisz badania aktywności optycznej związków biologicznych za pomocą pierwszo- i drugorzędowej białek. ramanowskiego. spektroskopii ramanowskiej. Literatura Barańska M., Malek K., Wesełucha-Birczyńska A. Spektroskopia Rozproszenia Ramana W: Wybrane metody spektroskopii i spektrometrii molekularnej w analizie strukturalnej, K. Malek, L.M. Proniewicz (red.), Wydawnictwo Naukowe UJ, 2005, 47−67. Kitagawa T., Hirota S. Raman spectroscopy of proteins. W: The Handbook of Vibrational Spectroscopy, Chalmers ed.: J.M and Griffiths P.R., John Wiley Sons, Chichester 2002. Twardowski J. Biospektroskopia tom IV, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 1990. Proteomika_7-13.indd 122 1/12/14 12:22:11 AM
Pobierz darmowy fragment (pdf)

Gdzie kupić całą publikację:

Proteomika i metabolomika
Autor:
, ,

Opinie na temat publikacji:


Inne popularne pozycje z tej kategorii:


Czytaj również:


Prowadzisz stronę lub blog? Wstaw link do fragmentu tej książki i współpracuj z Cyfroteką: